تونسي المولد و جزائري الاصل من مدينة طولقة بسكرة الجنوب الشرقي للجزائر من زاوية سيدي علي بن عمر.

تخرج محمد الخضر الحسين في جامع الزيتونة بتونس ومن أقرانه الذين كانوا رفقائه في جامع الزيتونة شيخ الزيتونة محمد الطاهر بن عاشور ومنصور أبوزبيدة الفيتوري أحد أهم علماء ليبيا.
أنشأ محمد الخضر حسين مجلة "السعادة العظمى" عام 1902م لتنشر محاسن الإسلام ثم عُهد إليه بقضاء بنزرت والخطابة بجامعها الكبير عام 1905م لكنه لم يمكث في عمله هذا طويلا فعاد إلى التدريس بجامع الزيتونة وتولى تنظيم خزائن كتبه ثم اختير للتدريس بالمدرسة الصادقية وكانت المدرسة الثانوية الوحيدة في تونس.

نزل محمد الخضر الحسين القاهرة سنة 1920م واشتغل بالبحث وكتابة المقالات ثم عمل محررًا بالقسم الأدبي بدار الكتب المصرية واتصل بأعلام النهضة الإسلامية في مصر وتوثقت علاقته بهم ثم تجنَّس المصرية وتقدَّم لامتحان شهادة العالمية بالأزهر وعقدت له لجنة الامتحان برئاسة العلامة عبد المجيد اللبان مع جماعة من علماء الأزهر وأعجبت به تلك اللجنة وبلغ من إعجاب رئيسها بالطالب أن قال: "هذا بحٌر لا ساحل له، فكيف نقف معه في حِجاج".

حصل على عضوية هيئة كبار العلماء برسالته "القياس في اللغة العربية" سنة (1370 هـ = 1950م) ثم اختير شيخا للأزهر في 26 ذي الحجة 1371هـ / 16 سبتمبر 1952م).
استقال في (2 جمادى الأولى 1373 هـ / 7 يناير 1954م).